آماده سازی محیط کشت

لینک دانلود و خرید پایین توضیحات

فرمت فایل word و قابل ویرایش و پرینت

تعداد صفحات: 105

آماده سازی محیط کشت

3-1 ترکیبات محیط کشت

بطور آشکار محیط کشت غذایی عامل مهم در کشت بافت و سلول بشمار می آید، البته برای هر کدام از گونه های درختی آزمایش های فاکتوریل که در آنها کلیه مواد شیمیایی محیط کشت در طیف وسیعی از غلظت های متغیر باشند، انجام نگرفته است. برای انجام چنین تحقیقی به امکاناتی بیش از آنچه که در اکثر آزمایشگاهها موجود است نیاز می باشد.

آنچه که طراحی محیط کشت را بطور خاصی مشکل می کند، اثرات متقابل بسیار پیچیدة مواد شیمیایی مختلف در یک محیط کشت غذایی مشخص می باشد. بعنوان مثال کاربرد بعضی از قندها ر محیط کشت سبب کمبود بر می شود. پیچیده تر از آن ا حالتی است که بر بیش از حد نیاز وجود داشته باشد در این حالت نیاز بافت به کلسیم کاهش خواهد یافت. به دلیل وجود چنی اثر متقابلی، تعیین ترکیبات مطلوب محیط کشت از طریق آزمایشهای فاکتوریل مشکل است. از طرفی این وضعیت با درنظر گرفتن این حقیقت که اثرات متقابل بین بافت و مواد غذایی تحت تأثیر شرایط محیطی از قبیل شدت و کیفیت نور، دورة نوری، درجه حرارت، آگار یا مایع بودن محیط کشت، PH، و غیره قرار می گیرند پیچید تر می گردد. بعلاوه عکس العمل بافت با تغیر وضعیت فیزیولوژیکی ریز نمونه با بافتی که واکشت شده فرق می کند.

محیط کشت های اولیه که در کشت بافت بکار می رود محلول های غذایی تغییر یافته کشت آبکشت گیاهان بود( محلول های غذایی ناپ، ففر و هوگلند- جورج و شرینتگتن) به این مواد مخلوطی از اسیدهای آمینه، ویتامینها و سایر ترکیبات آلی اضافه می شد. امروزه اکثر کشتهایی که استفاده می شوند نوع تغییر یافتة محیط های قدیمی هستند با بررسی فهرستی مشتمل بر 260 محیط کشت بافت گیاهی تنها 39 محیط کشت دارای ترکیبات پایه بودند محیط کشت موراشی و اسکوک (MS )بین سایر محیط کشت های گیاهی بیشترین کاربرد را دارد. از میان محیط کشت های ذکر شده توسط جرج و شرینتگتن، 53 محیط کشت از نظر فرمول عناصر پرمصرف مشابه محیط کشت MS بودند ولی در قسمت های دیگر تفاوت داشتند.

اکثر محیط کشت ها از طریق آزمون و خطا بتدریج بهبود یافته اند. البته در برخی از محیط کشت ها روش تجربی کمتر بکار رفته است. مقدار مواد معدنی موجود د محیط کشت MS براساس تجزیه خاکستر بافت توتون سوزانده شده می باشد. محیط کشت LM که اغلب برای سونی برگها استفاده می شود براساس تجزیة ترکیب شیمیایی آرکگونهای بذر نابالغ Pseudostsuha menziesii است البته هیچ گونه تضمینی وجود ندارد که این محیط کشت ها برای تمام ژئوتیپ ها مطلوب باشند یا اینکه چنین تجزیه شیمیایی برای تمام انواع بافتهای گونه های مختلف انجام شده باشد. محیط کشت موردنیاز جهت رشد کالوس نسبت به محیط کشت برای ایجاد و رشد ساقه بایستی دارای مواد معدنی با غلظت بیشتری باشد در حالیکه محیط کشت موردنیاز جهت ایجاد و رشد ریشه فرق می کند محیط کشتی که برای کشت پروتوپلاست بکار می رود اغلب با محیط کشتی که برای پروتوپلاست استفاده می شود بطور کامل تفاوت دارد. از طرف دیگر گونه هایی وجود دارد که درطیف وسیعی از محیط کشت های بخوبی رشد می کنند؛ یعنی محیط کشتهای مطلوب و مشخصی برای اینها وجود ندارد. همچنین حالت هایی و جود دارند که در آنها تهیه یک ژئوتیپ مناسب از تهیه یک محیط کشت مطلوب و دقیق مهمتر است. چنین حالتی برای جنس Populus وجود دارد. بعضی از ژئوتیپهای این جنس روی محیطهای آزمایش شده خیلی ضعیف رشد می کنند در برخی از گونه ها هر رقم دارای نیازهای غذایی مخصوص به خود است.

جرج و همکاران براساس مواد تشکیل دهنده، محیط کشت بافتهای گیاهی را به چهار دسته عمده، عناصر پرمصرف، عناصر کم مصرف، ویتامینها و اسیدهای آمینه یا آمیدها تقسیم کرده اند. برخی از محیط کشت ها مانند وایت، موراشی واسکوگ، گامبور و همکاران(B5 ) لیتوی و لوید و مک کاون محیط کشت های پایه یا تقریباً پایه هستند. بسیاری از محیط کشتهای مورد استفاده دیگر آنهایی هستند که در اثر تغییر کلی یا جزئی محیط کشت های پایه حاصل شده اند.

عناصر پرمصرف محیط کشت موراشی و اسکوگ اغلب در حد یا غلظت محیط پایه رقیق می شوند به همین ترتیب چنین کاری در سایر محیط کشت ها که غلظت عناصر در آنها بالاست انجام می گیرد.

علاوه بر طبقه بندی محیط کشتهای ذکرشده در بالا محیط کشتها را می توان به دو حالت مایع و جامد نیز تقسیم کرد. در حالت جامد محیط دارای عامل ژله کننده است که بافت کشت شده را روی سطح محیط نگه می دارد. این محیط کشتها همچنین درای ویتامینها، اسیدهای آمینه، تنظیم کننده های رشد کربوهیدراتها و اغلب سایز مواد تشکیل دهنده موردنیاز نیز هست.

3-1-1 عوامل تولیدکنندة ژل و جایگزینی آنها

3-1-1-1 آگار و دیگر مواد تولید کننده ژل

آگار از رایجترین عامل تولید ژل است که در محیط کشت استفاده می شود. آگار پلی ساکاریید هایی پیچیده است که از برخی گونه های نوعی علف هرز دریایی بدست می آید آگار طی مراحل ساخت در جات متفاوتی از خلوص را طی میکند. ولی مقداری ناخالصیهای آلی و معدنی در آن باقی می ماند. دیفکوباکتوآگار از رایجترین آگار مصرفی در کشت بافت است که دارای مقدار زیادی سدیم و مس می باشد. میزان سدیمی که از طریق آگار در محیط کشت وارد می شود براحتی توسط بافت اکثر گیاهان تحمل می شود. اما گاهی اوقات مس در محیط کشت ایجاد سمیت می کند. محققان اغلب آگار را در غلظت های بین 5/0 و 1 درصد بکار می برند غلظت مناسب آگار برای هر نوع محیط کشت ریز نمونه باید تعیین شود. غلظت خیلی بالای آن منجر به تنش آب در بافت می شود و غلظت های کم آن یک لایه مایع روی سطح ژله تشکیل خواهد داد و غرق شدن ریزنمونه در این لایه مایع مانع از مبادلات گازی شده و به کاهش رشد منجر می شود. بعلاوه کشت ریزنمونه روی محیط کشت مایع می تواند باعث شیشه ای شدن کشتها شود علیرغم آنچه بیان شد بعضی از کتشها روی محیط با غلظت کم آگار رشد بهتری دارند. بعنوان مثال ماده خشک در نوک شاخه های Picea obies در